Kollagene sind – im Vergleich zu anderen Molekülen des menschlichen Körpers – riesig. Bis zu 3.000 Aminosäuren bilden eine lange Kette, eine so genannte Polypeptidkette. Je drei dieser in sich gedrehten Proteinketten bilden zusammen eine Tripelhelix. Wie ein festes Seil oder Tau verbinden sich diese wiederum zu einem dicken Faserbündel, dem Kollagen. Dieser vielschichtige Aufbau des Kollagens erklärt seine bemerkenswerte Festigkeit sowie Druckresistenz, was seinen „Einsatzort“ unter anderem in menschlichen Gelenken und Knorpeln begründet.
Übersicht der Kollagentypen: I, II und III
In Säugetieren gibt es eine Vielzahl verschiedener Kollagenarten. Zählt man alle von der Wissenschaft entdeckten Kollagene auf, erreicht man tatsächlich 19 verschiedene Kollagentypen. Die geläufigsten sind jedoch Kollagen-Typ I, Typ II und Typ III, beziehungsweise Typ 1, Typ 2 sowie Typ 3.
Das Kollagen-Typ I ist das mengenmäßig bedeutendste Kollagen in Mensch sowie Tier und kommt vor allem im Bindegewebe vor. Aus dem Bindegewebe vorzugsweise von Schweinen und Rindern, besonders aus der Haut und den Knochen, wird durch Behandlung mit Säuren, Basen oder durch Kochen Gelatine hergestellt. Das Kollagen der Gelatine ist durch die Chemikalien und die Hitze denaturiert worden.
Das Kollagen-Typ II ist vor allem als „Knorpel-Kollagen“ bekannt. Es ist Hauptbestandteil von Faserknorpeln, hierzu zählen verschiedene Gelenke und die zugehörigen Knorpel: Hüftgelenks-, Schultergelenks- sowie Kniegelenksknorpel. Kollagen vom Typ II ist auch Substanz von hyalinen Knorpeln, aus denen unter anderem die Rippen und die Bronchien bestehen.
Das Kollagen-Typ III kommt vor allem in der Haut, der Skelettmuskulatur, den inneren Organen sowie den Blutgefäßen vor.
Denaturiert oder nicht denaturiert? Hydrolysiert oder nativ?
Ist ein Protein oder Kollagen „denaturiert“, wurde es durch Hitze oder Chemikalien grundlegend in seiner natürlichen Molekülstruktur verändert, wodurch seine biologische Funktion vollständig verlorengeht. Ein „hydrolysiertes“ Kollagen oder „Collagenhydrolysat“ wurde noch weiterverarbeitet und die Kollagenketten zu sehr kleinen Bruchstücken aufgespalten. Diese kurzen Eiweißbruchstücke haben keinerlei Funktion mehr, sie werden lediglich verstoffwechselt und ausgeschieden.
Ein „nicht-denaturiertes“ Kollagen, wie das „native Typ-II-Kollagen“ (UC-II® Kollagen), wird ohne Hitze und mit so wenigen Verarbeitungsschritten wie möglich hergestellt. Aus diesem Grund bleibt die räumliche Struktur des Kollagens (die Tertiärstruktur) intakt und seine biologische Funktion erhalten. „Nativ“ bedeutet in diesem Zusammenhang, dass sich das Kollagen in seinem natürlichen Zustand befindet und unverändert ist.
UC-II® Kollagen: Das beste Kollagen, von der Wissenschaft bestätigt
Diese besondere, auch als „undenaturiert“ oder „nicht denaturiert“ bezeichnete Kollagenform (UC-II® Kollagen) bleibt dank des patentierten Herstellungsprozesses in seiner biologischen Aktivität erhalten. UC-II® Kollagen wird nur so viel bearbeitet, wie nötig ist, um es zu konzentrieren und löslich zu machen. Die Struktur der Triplehelix bleibt erhalten und das Kollagen behält seine natürliche Oberflächenstruktur. Die dort befindlichen Oberflächenantigene werden vom Immunsystem erkannt und somit kann ein zielgerichteter Reparaturmechanismus im Gelenk ausgelöst werden. Dies erklärt, warum – im Gegensatz zu herkömmlichen, denaturierten Kollagen mit zerstörter Proteinstruktur – nur so geringe Mengen UC-II® Kollagen pro Tag notwendig sind. Klinische Studien , belegen sowohl die Effektivität als auch die hervorragende Verträglichkeit von UC-II® Kollagen. Aufgrund seiner intakten, komplexen und festen Struktur, kann das wertvolle undenaturierte Kollagen nicht durch die Verdauungsenzyme und die Magensäure zerstört werden. Es wird über spezielle Dünndarmzellen aufgenommen und kann so direkt vom Körper genutzt werden.
In bester Gesellschaft: UC-II® Kollagen, N-Acetyl-Glucosamin, Chondroitin …
In flexiLoges® Gelenknahrung wird das patentierte UC-II® Kollagen mit weiteren Gelenk-Nährstoffen wie N-Acetyl-Glucosamin (NAG) und Chondroitin, Methylsulfonylmethan (MSM), Bambus-Extrakt sowie den Mikronährstoffen Vitamin C, Mangan und Molybdän kombiniert. Das besondere Nährstoffkonzept versorgt den Bewegungsapparat zu jeder Tages- und Nachtzeit mit den benötigten Gelenknährstoffen um zu einer normalen Knorpel- und Knochenfunktion beizutragen. So können die Gelenke auch bei Gelenkbeschwerden voll beweglich bleiben und der Weg für Bewegung sowie aktiven Sport ist frei.
TitelQuantifying adhesive interactions between cells and extracellular matrix by single-cell force spectroscopyZitierfähige Url://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa-24758Datum der Einreichung04.05.2009Datum der Verteidigung07.10.2009Abstract (DE)Interaktionen zwischen Zellen und ihrer Umgebung sind maßgeblich an der Regulierung zellulärer Funktionen beteiligt und daher notwendig für die Organisation von Zellen in Geweben und komplexen Organismen. Zellinteraktionen mit der extrazellulären Matrix (EZM) werden hauptsächlich durch Integrine vermittelt. Situationen, in denen Integrin- EZM Interaktionen verändert sind, können Krankheiten verursachen und spielen zudem eine wichtige Rolle bei der Invasion von Krebszellen. Daher besteht ein großes Interesse darin, die molekularen Mechanismen, die Integrin-EZM Interaktionen regulieren, besser zu verstehen. Wie können Zell-EZM Interaktionen untersucht werden? Obwohl es mehrere Methoden gibt, mit denen Zelladhäsion untersucht werden kann, sind die wenigsten dazu geeignet, Zelladhäsionskräfte zu quantifizieren. Einzelzellspektroskopie erfasst die Adhäsionskräfte einzelner Zellen quantitativ und ermöglicht dadurch eine differenzierte Betrachtung der Adhäsion individueller Zellen. Eine Variante der Einzelzellspektroskopie basiert auf der Rasterkraftmikroskopie (AFM); diese Technik wurde in der vorliegenden Arbeit verwendet. Ein Vorteil von AFM- Einzelzellspektroskopie besteht darin, dass Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Präzision manipuliert werden können. Zelladhäsionskräfte können zudem über einen großen Kraftbereich hinweg untersucht werden. Dabei ermöglicht es die hohe Kraftauflösung, einzelne Integrin-Ligandenbindungen in lebenden Zellen zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit gliedert sich in sechs Kapitel. Kapitel eins gibt Hintergrundinformationen über Zell-EZM Wechselwirkungen. In Kapitel zwei werden verschiedene Adhäsionsassays einander gegenüber gestellt. Das theoretische Bell-Evans Modell, mit dessen Hilfe die gewonnenen Daten interpretiert wurden, wird in Kapitel drei diskutiert. Im Anschluss werden drei Projekte, welche das Herzstück dieser Doktorarbeit bilden, in Kapiteln vier bis sechs näher ausgeführt. Im ersten Projekt (Kapitel vier) wurde die Adhäsion von α2β1-Integrin exprimierenden CHO Zellen zu Kollagen I, dem häufigsten strukturellen Protein in Wirbeltieren, quantitativ untersucht. Zunächst wurden α2β1-Kollagen-Interaktionen auf Einzelmolekülebene analysiert. Mithilfe der dynamischen Kraftspektroskopie wurden für diese Bindung Dissoziationsrate koff (1.3 ± 1.3 sec-1) und Potentialbarrierenbreite xu (2.3 ± 0.3 Å) bestimmt. Daraufhin wurde die α2β1-vermittelte Adhäsion über einen Zeitraum von zehn Minuten untersucht. Dadurch konnten Einblicke in die Kinetik von α2β1-integrin vermittelter Zelladhäsion sowie in die zugrunde liegenden Regulationsmechanismen gewonnen werden. Im zweiten Projekt (Kapitel fünf) wurde die Rolle von kryptischen Integrin-Bindungsstellen in Kollagen I untersucht. Die zuvor verwendeten Kollagenoberflächen wurden thermisch denaturiert, wodurch versteckte RGD (Arg-Gly-Asp)-Sequenzen freigelegt wurden. Die partielle Denaturierung hatte- verglichen mit nativem Kollagen I- eine erhöhte Adhäsion von Präosteoblasten (MC3T3-E1) zur Folge, was auf das Binden zusätzlicher Integrine zurückgeführt wurde. Im Unterschied zu nativem Kollagen wurde die Zelladhäsion zu denaturiertem Kollagen I u.a. durch αv- and α5β1-Integrine vermittelt. Präosteoblasten zeigten verstärktes Zellspreiten sowie höhere Motilität auf denaturiertem Kollagen I; zudem wurde ein erhöhtes Differenzierungpotential der Präosteoblasten festgestellt. Die in diesem Projekt erhaltenen Einblicke bilden eine hilfreiche Basis für die Entwicklung optimierter Oberflächen für diverse Zell- und Gewebekulturanwendungen. Im dritten Projekt (Kapitel sechs) wurde der Einfluss des Fusionproteins BCR/ABL, charakteristisch für chronische myeloische Leukämie, auf die Adhäsion von myeloischen Vorläuferzellen untersucht. Dazu wurde die Adhäsion von BCR/ABL transformierten Vorläuferzellen (32D Zellen) bzw. Kontrollzellen zu Stromazellen (M2-10B4) sowie verschiedenen EZM Proteinen untersucht. BCR/ABL erhöhte die Zelladhäsion der myeloischen Vorläuferzellen signifikant. Dieser Effekt wurde durch die Zugabe von Imatinib, welches die Tyrosinkinaseaktivität von BCR/ABL inhibiert, aufgehoben. Die BCR/ABL-verstärkte Zelladhäsion korrelierte mit erhöhten β1-Integrin-konzentrationen. Da die Adhäsion von Leukämiezellen im Knockenmark bekanntermaßen kritisch für die Entwicklung von Resistenzen gegenüber verschiedenen Wirkstoffen ist, könnten die Ergebnisse dieser Studie eine Grundlage für die Entwicklung optimierter Target-Therapien sein. In den drei beschriebenen Projekten wurde AFM Einzelzellspektroskopie verwendet, um Integrin- vermittelte Adhäsion auf molekularer Ebene zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass AFM-Einzelzellspektroskopie ein vielseitiges Werkzeug darstellt, das überaus geeignet dazu ist, Zelladhäsion- ausgehend von Einzelmolekülinteraktionen bis hin zur Entstehung komplexerer Adhäsionsstellen- auf der Kraftebene zu verfolgen.Abstract (EN)Interactions of cells with their environment regulate important cellular functions and are required for the organization of cells into tissues and complex organisms. These interactions involve different types of adhesion receptors. Interactions with extracellular matrix (ECM) proteins are mainly mediated by the integrin family of adhesion molecules. Situations in which integrin-ECM interactions are deregulated cause diseases and play a crucial role in cancer cell invasion. Thus, the mechanisms underlying integrin-binding and regulation are of high interest, particularly at the molecular level. How can cell-ECM interactions be studied? While there are several methods to analyze cell adhesion, few provide quantitative data on adhesion forces. One group, single-cell force spectroscopy (SCFS), quantifies adhesion at the single-cell level and can therefore differentiate the adhesive properties of individual cells. One implementation of SCFS is based on atomic force microscopy (AFM); this technique has been employed in the presented work. Advantageously AFM-SCFS combines high temporal and spatial cell manipulation, the ability to measure a large range of adhesion forces and sufficiently high-force resolution to allow the study of single-molecule binding events in the context of a living cell. Since individual adhesion receptors can be analyzed within their physiological environment, AFM-SCFS is a powerful tool to study the mechanisms underlying integrin-regulation. The presented work is split into six chapters. Chapter one gives background information about cell-ECM interactions. In chapter two, different adhesion assays are compared and contrasted. The theoretical Bell-Evans model which is used to interpret integrin-mediated cell adhesion is discussed in chapter three. Thereafter, the three projects that form the core of the thesis are detailed in chapters four through six. In the first project (chapter 4), α2β1-integrin mediated cell adhesion to collagen type I, the most abundant structural protein in vertebrates, was quantified using CHO cells. Firstly, α2β1-collagen interactions were investigated at the single-molecule level. Dynamic force spectroscopy permitted calculation of bond specific parameters, such as the bond dissociation rate koff (1.3 ± 1.3 sec-1) and the barrier width xu (2.3 ± 0.3 Å). Next, α2β1-integrin mediated cell adhesion to collagen type I was monitored over contact times between 0 and 600 sec. Thereby the kinetics of α2β1-integrin mediated interactions was explored and insights into the underlying binding mechanisms were gained. In the second project (chapter five), effects of cryptic integrin binding sites within collagen type I exerted on pre-osteoblasts were investigated. Collagen type I matrices were thermally denatured which lead to exposure of cryptic RGD (Arg-Gly-Asp)-motifs. As a consequence pre-osteoblasts enhanced their adhesion to denatured collagen. Compared to native collagen type I, adhesion to denatured collagen was mediated by a different set of integrins, including αv- and α5β1-integrins. Cells grown on denatured collagen showed enhanced spreading and motility, which correlated with increased focal adhesion kinase phosphorylation levels. Moreover, osteogenic differentiation kinetics and differentiation potential were increased on denatured collagen. The findings of this project open new perspectives for optimization of tissue engineering substrates. In the third part (chapter six), the effect of the fusion protein BCR/ABL, a hallmark of chronic myeloid leukemia, on adhesion of myeloid progenitor cells was studied. Adhesion between BCR/ABL transformed progenitor cells to bone marrow derived stromal cells and to different ECM proteins was quantitatively compared to that of control cells. The tyrosine kinase activity of BCR/ABL enhanced cell adhesion, which was blocked by imatinib mesylate, a drug interfering with BCR/ABL activity. BCR/ABL-enhanced adhesion correlated with increased β1-integrin cell surface concentrations. Since adhesion of leukemic cells to the bone marrow compartment is critical for the development of drug resistance, the reported results may provide a basis for optimized target therapies. In the three described projects AFM-based SCFS was applied to investigate early steps of integrin-mediated adhesion at the molecular level. Taken together, the results demonstrate that AFM-SCFS is a versatile tool that permits monitoring of cell adhesion from single-molecule interactions to the formation of more complex adhesion sites at the force level.Freie Schlagwörter (DE)Zelladhäsion, Rasterkraftmikroskopie (AFM), Einzelzellkraftspektroskopie, Integrine, Extrazeluläre Matrix, Kollagen IFreie Schlagwörter (EN)cell adhesion, atomic force microscopy (AFM), single-cell force spectroscopy, integrins, extracellular matrix, collagen type IKlassifikation (DDC)620Klassifikation (RVK)WE 2301GutachterIn
- Prof. Dr. Daniel J. Müller
- Prof. Dr. Anthony Hyman
- Prof. Dr. Dietmar W. Hutmacher
- Prof. Dr. Daniel J. Müller